Эффективное производство это: Как сделать производство эффективным: 5 действенных способов

Содержание

Как сделать производство эффективным: 5 действенных способов

Начать собственное дело и открыть производственное предприятие – задача не из легких. Еще более сложное задание – создать дело эффективное и успешное, которое будет стабильно приносить доход и развиваться.

К сожалению, большая часть производств рано или поздно сталкивается с проблемами: некоторые из них не могут выйти на точку «безубыточности», другие не в силах развиваться и подстраиваться под спрос потребителей.

Решать такие проблемы можно и даже нужно. Только постоянно контролируя производство и его прибыльность можно достичь успеха.

Прямо сейчас мы расскажем, каким должно быть успешное предприятие, и как сделать производство эффективным.

Что такое эффективное производство?


Однозначно ответить на вопрос, что же такое эффективное производство, весьма сложно. Каждый предприниматель подразумевает свои необходимые составляющие успешного предприятия.

Но прежде, чем мы начнем искать способы повышения эффективности производства, нужно выяснить, каким основным требованиям отвечает то самое «образцовое» предприятие.

Если упорядочить все основные характеристики эффективного производства, сможем сделать вывод о том, что оно должно соответствовать 5 главным критериям.

Итак, эффективное производство – это предприятие, которое:

  • Изготавливает товары высокого качества.
  • Производит те продукты или товары, в которых нуждается целевая аудитория.
  • Осуществляет свою деятельность в срок.
  • Изготавливает товары в быстром темпе.
  • Работает со стабильно высоким доходом и минимальными затратами.

Выходит, что эффективное производство – это то предприятие, которое и приносит доход, и позволяет сократить расходы на изготовление товаров, и является необходимым на рынке, так как в его продукции нуждаются потребители.

Доходы и расходы бюджета – всё, что нужно знать про БДиР

На деле действительно важно, чтобы производство удовлетворяло и потребности целевой аудитории, и предпринимателя. Но если выделять из общего перечня факторов самый важный, то мы получим следующий ответ на интересующий нас вопрос:

Эффективное производство – это предприятие, которое приносит высокий доход с минимальными вложениями.

Именно такая формулировка предполагает понятие эффективности.

Сама по себе эффективность производства предполагает правильное использование ресурсов, вложение средств, организованную и слаженную работу коллектива предприятия.
В таком случае, как сделать производ

Показатели эффективности производства: инструменты + анализ

Оценка показателей эффективности производства позволяет понять, насколько итоговый результат, такой как товар или услуга, соответствует заранее просчитанному бизнес-плану.

Если рассматривать ПЭ в целом, то она отображает общую результативность производства, а высокие параметры свидетельствуют о качестве экономического роста.

И всё же, ответ на эту тему не уместить в три строки, поэтому сегодня в статье мы рассмотрим, как проводится анализ производительности бизнеса, ключевые показатели эффективности, а также принципы подсчёта и управления результативностью фирмы.

Правила управления и подсчёта ЭП


Чтобы понять, каким образом подсчитываются показатели эффективности бизнеса, нужно узнать, что это вообще такое – эффективный бизнес.

В первую очередь, под этим термином подразумевается совокупность таких показателей, как рентабельность, результативность, постоянная средняя прибыль, темпы развития и процветания.

Как не трудно догадаться, любая предпринимательская деятельность подразумевает под собой получение максимальной прибыли наиболее выгодными способами, соответственно, соотношение между прибылью и затраченными ресурсами и будет называться эффективностью.

Для оценки производительности, предприниматель может просматривать отчёты рентабельности и сроков окупаемости, это и даёт общее понимание успешности предприятия.

Показатели эффективности производственного процесса обычно разделяются на три группы:

  1. Финансовые показатели эффективности производства – это общая рентабельность бизнеса, управление финансовыми потоками, рыночная стоимость предприятия, ликвидность финансовых поступлений и так далее.
  2. Успешность внутрипроизводственного менеджмента – сбыт продукции, результативность управления и ресурсных затрат, развитие и обучение персонала.
  3. Результативность внешнеэкономических связей – это лояльность поставщиков и потребителей, а также то, насколько потребители удовлетворены количеством и качеством поставляемой продукции.

Рассматривая системы управления, предприниматель должен соблюдать пять основных правил, которые применяются во всех сферах и областях производства.

1. Полная компетентность и осведомлённость в сфере деятельности


Невозможно вести успешный бизнес, не зная о всех факторах, нюансах, тонкостях и особенностях процесса. Поэтому, если предприниматель начал работать в определённой сфере, для улучшения результативности процесса ему нужно будет детально ознакомиться с ситуацией на производстве.

Бизнес по производству

Только полная осведомлённость во всех пр

Эффективность производства и ее показатели. Пути и факторы повышения эффективности производства

В основе экономического прогресса лежит повышение эффективнос­ти производства.

Эффективность общественного производства — это соотношение конечного результата производства — про­дукта и затрат совокупного труда на его получение. Иными словами, критерием эффективности общественного производства является достижение наивысших результа­тов с наименьшими затратами.

Эко­номическая эффективность - это достижение наиболь­ших результатов при наименьших затратах, или снижение совокупных затрат на единицу продукции.

Социальная эффективностьэто соответствие ре­зультатов хозяйственной деятельности социальным целям общества. Она выражает степень удовлетворения всей совокупности потребностей за счет создаваемого продукта и связана с уровнем жизни населения, содержанием и условиями труда, состоянием среды обитания человека, масштабами свободного времени.

Социальная эффективность предполагает усиление социальной ориентации экономического роста. Недопустимо увеличение производства за счет ухудшения условий труда, нанесения ущерба окру­жающей среде, снижения других показателей жизнедея­тельности человека.


Показатели эффективности.

Для характеристики эф­фективности производства применяется система показате­лей, таких как качество продукции, соответствие ее обще­ственным потребностям, производительность труда, фон­довооруженность, фондоотдача, фондо- и материалоемкость.

1. Качество продукцииважнейший показатель эффективности производства. Расширение выпуска высо­кокачественной продукции — признак интенсивного типа развития производства, характерная черта научно-технического прогресса.

2. Соответствие результатов производства общественным потребностям.

3. Производитель­ность труда. Производительность труда выражается в количестве потребительных стоимостей, произведенных в единицу времени, или величиной времени, затрачиваемого на единицу продукции. Повышение производительности труда зависит от квалификации работников, их опыта, уровня организа­ции производства. На производительность труда влияет величина и особенно качество фондовооруженности труда. Последняя измеряется отношением стоимости фондов к затратам живого труда (численности работников).

4. Фондо­отдача характеризует эффективность использования ос­новных и производственных фондов и измеряется количе­ством продукции, приходящейся на данную величину ос­новных фондов.


5. Фондоемкость — стоимость основных производственных фондов на единицу объема производст­ва продукции. Снижение фондоемкости означает рост эф­фективности воспроизводства и использования основных производственных фондов.

6.

Материалоемкость - один из важных показателей эффективности использования ма­териальных ресурсов — сырья, материалов, топлива, энер­гии и т.д. Она определяется отношением стоимости мате­риальных затрат к величине произведенной продукции.

Обобщающими показателями экономической эффек­тивности являются норма прибыли и уровень рентабель­ности.

Прибыль в рыночных условиях - главная цель предпринимательства и критерий эффективности произ­водства. Показателем эффективности здесь выступает норма прибыли как отношение полученной прибыли к затратам на производство.

Рентабельность характеризует результативность ис­пользования средств производства и трудовых ресурсов. Она определяется как отношение полученной предприяти­ем прибыли к сумме основных и оборотных фондов.

Пути и факторы повышения эффективности произ­водства.

Повышению эффективности общественного про­изводства способствуют освоение достижений научно-тех­нической революции, научная организация труда, рацио­нальная система специализации и кооперирования произ­водства, развитие инициативы и самостоятельности трудо­вых коллективов, структурная и организационная пере­стройка национальной экономики, совершенствование хо­зяйственного механизма, использование преимуществ меж­дународного разделения труда, совершенствование систе­мы стимулирования и мотивации труда.

Факторами повышения эффективности общественного производства можно считать научно-технические, организа­ционно-экономические, социально-психологические и внеш­неэкономические условия функционирования производства.

Содержание эффективности производства.

В основе экономического прогресса лежит повышение эффективности производства. Специфическое содержание эффективности в каждой системе хозяйства определяется общественной формой производства, его целевой направленностью, своеобразием факторов и результатов производства. На всех этапах исторического развития общество интересовал вопрос: ценой каких затрат и ресурсов достигается конечный производственный результат?

Эффективность общественного производства — это соотношение конечного результата производства — продукта П и затрат совокупного труда Т на его получение. Иными словами, критерием эффективности общественного производства является достижение наивысших результатов с наименьшими затратами. В наиболее общей форме эффективность общественного производства можно выразить как отношение П:Т.

В национальной экономике эффективность общественного производства измеряется величиной национального дохода, а по отдельным регионам, отраслям, объединениям и предприятиям - величиной чистой продукции, отнесенных к соответствующим затратам общественного труда, а также темпами роста этих показателей.

Важным требованием эффективности общественного производства является производство потребительных стоимостей, в наиболее полной мере соответствующих по качеству и составу потребностям общества. Радикальная экономическая реформа, всесторонняя демократизация общественной жизни создают предпосылки для повышения эффективности общественного производства.

Показатели эффективности.

Для характеристики эффективности производства применяется система показателей, таких как качество продукций, соответствие ее общественным потребностям, производительность труда, фондовооруженность, фондоотдача, фондо- и материалоемкость. Рост качества продукции — важнейший показатель эффективности производства. Расширение выпуска высококачественной продукции — признак интенсивного типа развития производства, характерная черта научно-технического прогресса.

Эффективность производства находит свое отражение в достижении соответствия его результатов общественным потребностям. Главным показателем эффективности производства является производительность труда. Некоторые экономисты их отождествляют. Производительность труда выражается в количестве по-гребительных стоимостей, произведенных в единицу времени, или величиной времени, затрачиваемого на единицу продукции. Повышение производительности труда зависит от квалификации работников, их опыта, уровня организации производства.

На производительность труда влияет величина и особенно качество фондовооруженности труда. Последняя измеряется отношением стоимости фондов к затратам живого труда (численности работников). Фондоотдача характеризует эффективность использования основных производственных фондов и измеряется количеством продукции, приходящейся на данную величину основных фондов. Фондоемкость — стоимость основных производственных фондов на единицу объема производства продукции.

Снижение фондоемкости означает рост эффективности воспроизводства и использования основных производственных фондов. Материалоемкость — один из важных показателей эффективности использования материальных ресурсов — сырья, материалов, топлива, энергии и т.д. Она определяется отношением стоимости материальных затрат к величине произведенной продукции.

Обобщающими показателями экономической эффективности являются норма прибыли и уровень рентабельности. Прибыль в рыночных условиях — главная цель предпринимательства и критерий эффективности производства. Показателем эффективности здесь выступает норма прибыли как отношение полученной прибыли к затратам на производство.

Рентабельность характеризует результативность использования средств производства и трудовых ресурсов. Она определяется как отношение полученной предприятием прибыли к сумме основных и оборотных фондов. Управление рентабельностью (планирование, обоснование и анализ-контроль) находятся в центре экономической деятельности предприятий, работающих на рынок.

В условиях перехода к рыночной экономике изменяются содержание и показатели эффективности производства. Поскольку основой рыночной экономики и предпринимательства является прибыль, в качестве первичного хозрасчетного показателя экономической рентабельности выступает максимизация прибыли на единицу затрат и ресурсов при высоком качестве продукции, работ и услуг, обеспечение конкурентоспособности.

В новых условиях сохраняется и общенациональный показатель эффективности: максимизация национального дохода, валового национального продукта на единицу затрат и ресурсов при повышающемся уровне благосостояния народа. Общенациональная эффективность производства зависит от эффективности производственной деятельности первичных ячеек производства (предприятия, объединения, акционерные общества, совместные предприятия). Чем эффективнее производственная деятельность первичных звеньев, тем выше эффективность национальной экономики, тем больше у общества ресурсов для решения социальных и экономических задач.

Возрастает связь экономических показателей эффективности с социальными. Чем выше экономические результаты, тем выше должны быть и социальные результаты и наоборот. Социальные результаты выражаются в таких показателях, как повышение уровня жизни, увеличение свободного времени, улучшение условий труда и экологической обстановки в регионе.

Пути и факторы повышения эффективности производства.

Повышению эффективности общественного производства способствуют освоение достижений научно-технической революции, научная организация труда, рациональная система специализации и кооперирования производства, развитие инициативы и самостоятельности трудовых коллективов, структурная и организационная перестройка национальной экономики, совершенствование хозяйственного механизма, использование преимуществ международного разделения труда, совершенствование системы стимулирования и мотивации труда.

Факторами повышения эффективности общественного производства можно считать научно-технические, организационно-экономические, социально-психологические и внешнеэкономические условия функционирования производства.

Экономическая эффективность — Википедия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Экономическая эффективность (англ. Economic efficiency) — это соотношение полученных результатов производства — продукции и услуг и затрат труда и средств производства.

Определение

Согласно П. Самуэльсону и У. Нордхаусу экономическая эффективность — это получение максимума возможных благ от имеющихся ресурсов, постоянно соотнося выгоды (блага) и затраты, при этом необходимо вести себя рационально. Производитель и потребитель благ стремятся к наивысшей эффективности, максимизируя при этом свои выгоды и минимизируя затраты[1].

Критерии эффективности

Главным критерием социально-экономической эффективности является степень удовлетворения конечных потребностей общества, и прежде всего потребностей, связанных с развитием человеческой личности. Социально-экономической эффективностью обладает та экономическая система, которая в наибольшей степени обеспечивает удовлетворение многообразных потребностей людей: материальных, социальных, духовных, гарантирует высокий уровень и качество жизни. Основой такой эффективности служит оптимальное распределение имеющихся у общества ресурсов между отраслями, секторами и сферами национальной экономики.

Эффективность экономической системы зависит от эффективности производства, социальной сферы (систем образования, здравоохранения, культуры), эффективности государственного управления. Эффективность каждой из этих сфер определяется отношением полученных результатов к затратам и измеряется совокупностью количественных показателей.

Измерение эффективности

Для измерения эффективности производства используются показатели производительности труда, фондоотдачи, рентабельности, прибыльности, окупаемости и др. С их помощью сопоставляются различные варианты развития производства, решения его структурных проблем.

Измерение эффективности социальной сферы требует использования особых[каких?] качественных показателей развития каждой из отраслей этой сферы.

Для государственной сферы необходимы специальные критерии соответствия затрат и результатов деятельности государства требованиям общества.

Эффективность производства

Экономически эффективным принято считать такой способ производства, при котором фирма не может увеличить выпуск продукции без увеличения расходов на ресурсы и одновременно не может обеспечить тот же объём выпуска, используя меньшее количество ресурсов одного типа и не увеличивая при этом затраты на другие ресурсы.

Эффективность производства складывается из эффективности всех действующих предприятий. Эффективность предприятия характеризуется производством товара или услуги с наименьшими издержками. Она выражается в его способности производить максимальный объём продукции приемлемого качества с минимальными затратами и продавать эту продукцию с наименьшими издержками. Экономическая эффективность предприятия, в отличие от его технической эффективности, зависит от того, насколько его продукция соответствует требованиям рынка, запросам потребителей.

Эффективность капитальных вложений

Одной из важных составляющих эффективности экономической системы является эффективность капитальных вложений. Она выражается отношением полученного эффекта к капитальным вложениям, вызвавшим этот эффект. Другими словами, это экономический эффект, приходящийся на один рубль инвестиций, обеспечивших этот эффект.

Эффективность капитальных вложений измеряется набором показателей, в который входит общий эффект капитальных вложений, норма их доходности, срок окупаемости, показатель эффективности и др… Показатели экономической эффективности капитальных вложений используются для сопоставления альтернативных инвестиционных проектов и выбора оптимального проекта.

Этика эффективности

Этика эффективности компаний предполагает сочетание:

  • создания наибольшей ценности для своих клиентов
  • доходность для собственников
  • возможности для самореализации и роста в сочетании с привлекательной зарплатой для сотрудников[2].

Показатели эффективности

Примечания


Разница между эффективностью и результативностью (со сравнительной таблицей)

Последнее обновление , Surbhi S

Эффективность означает все, что вы производите или выполняете; это должно быть сделано безупречно. Хотя Эффективность имеет более широкий подход, что означает степень, в которой были достигнуты фактические результаты для достижения желаемого результата, то есть выполнения точных действий. Это метрика, используемая для измерения производительности сотрудника в организации.

Эффективность и Эффективность - это два слова, которые люди чаще всего противопоставляют друг другу; они используются вместо друг друга, однако они разные. В то время как эффективность - это состояние достижения максимальной производительности с минимальными затратами усилий, эффективность - это степень, в которой что-то успешно обеспечивает желаемый результат.

Прочтите статью, чтобы понять разницу между эффективностью и результативностью в управлении.

Содержание: эффективность против эффективности

  1. Таблица сравнения
  2. Определение
  3. Ключевые отличия
  4. Заключение

Сравнительная таблица

Основа для сравнения Эффективность Эффективность
Значение Эффективность известна как эффективность. Степень близости фактического результата к желаемому, известна как эффективность.
Что это? Работа должна выполняться правильно. Делаем аккуратную работу.
Акцент на Входы и выходы Средства и цели
Горизонт времени Кратковременный Долгий
Подход Интроверт Экстраверт
Установление Реализация стратегии Формулировка стратегии
Ориентация Операции Стратегии

Определение эффективности

Под эффективностью понимается способность производить максимальную отдачу от заданного входа с наименьшими потерями времени, усилий, денег, энергии и сырья.Его можно измерить количественно путем расчета и достижения соотношений затрат и выпуска ресурсов компании, таких как фонды, энергия, материалы, рабочая сила и т. Д.

Эффективность также считается параметром для расчета производительности и продуктивности путем сравнения запланированных результатов и фактических результатов, произведенных при фиксированном количестве входов. Это способность делать что-то хорошо воспитанным и добиваться стандартного результата.

Эффективность - важный элемент использования ресурсов, так как их очень мало, и они имеют альтернативное использование, поэтому их необходимо использовать наилучшим образом.

Определение эффективности

Эффективность означает степень, в которой что-то было сделано для достижения намеченного результата. Это означает степень близости достигнутой цели с заранее определенной целью для проверки потенции всей сущности.

Эффективность имеет внешний вид, то есть раскрывает взаимосвязь бизнес-организации с макро-средой бизнеса. Он ориентирован на достижение конкурентной позиции на рынке.

Эффективность ориентирована на результат, который показывает, насколько хорошо было выполнено действие, которое привело к достижению намеченного результата, который является точным или близким к идеальному.

Ключевые различия между эффективностью и результативностью

Пункты, приведенные ниже, описывают существенные различия между эффективностью и эффективностью:

  1. Способность производить максимальную производительность с ограниченными ресурсами известна как эффективность. Степень близости фактического результата к запланированному результату - Эффективность.
  2. Эффективность - это «делать вещи идеально», а результативность - «делать идеальные вещи».
  3. Эффективность имеет краткосрочную перспективу. И наоборот, долгосрочная перспектива - это точка зрения на эффективность.
  4. Эффективность ориентирована на доходность. В отличие от эффективности, ориентированной на результат.
  5. Эффективность должна поддерживаться во время реализации стратегии, в то время как формулировка стратегии требует эффективности.
  6. Эффективность измеряется в операциях организации, но измеряется эффективность стратегий, которые разрабатывает организация.
  7. Эффективность - это результат фактического выпуска при заданном количестве входов. С другой стороны, эффективность связана со средствами и целями.

Заключение

Эффективность и результативность занимают видное место в деловой среде, которая должна поддерживаться организацией, потому что ее успех зависит от них. Эффективность имеет интроспективный подход, то есть она измеряет производительность операций, процессов, работников, затрат, времени и т. Д.внутри организации. Он четко ориентирован на сокращение затрат или потерь или устранение ненужных затрат для достижения результата с указанным количеством затрат.

В случае эффективности, это экстравертный подход, который подчеркивает отношения бизнес-организации с остальным миром для достижения конкурентной позиции на рынке, то есть помогает организации оценивать эффективность всей организации по выработка стратегии и выбор лучших средств для достижения результата.

Специалисты по управляемым фьючерсам

Информация на этом веб-сайте предназначена для использования только физическими и юридическими лицами, которые являются «правомочными лицами», как определено в Положении 4.7 Комиссии по торговле товарными фьючерсами. Прошлые результаты не обязательно указывают на будущие результаты. Торговля фьючерсами и опционами чрезвычайно спекулятивна и очень рискованна и подходит не всем инвесторам. Не может быть никакой гарантии, что счет или фонд вообще будут приносить какую-либо прибыль или смогут избежать существенных убытков, включая полную потерю инвестиций.

Этот веб-сайт предназначен только для информационных целей и не является предложением о продаже; приветствие предложения о покупке или рекомендации о покупке любой ценной бумаги. Инвестиции предлагаются только на основании соответствующего Меморандума о частном размещении и другой документации о предложении и в соответствии со всеми применимыми законами. На этом веб-сайте не описываются все различные риски, связанные с инвестированием в управляемые фьючерсы или обмен иностранной валюты, список которых находится в наших предлагаемых документах фонда и наших заполненных анкетах для комплексной проверки.Мы можем предоставить вам эти документы или список по запросу.

В связи с освобождением от Комиссии по торговле товарными фьючерсами в связи со счетами квалифицированных правомочных лиц, этот документ не требуется и не подавался в комиссию. Комиссия по торговле товарными фьючерсами не умаляет достоинств участия в торговой программе или адекватности или точности раскрытия информации советником по торговле товарными фьючерсами. Следовательно, Комиссия по торговле товарными фьючерсами не рассмотрела и не одобрила эту торговую программу или любую информацию на этом веб-сайте.Ничто, содержащееся на этом веб-сайте, не является инвестиционной, юридической или налоговой консультацией.

Логотип Efficient Capital® и Efficient Capital Management® являются зарегистрированными товарными знаками Efficient Capital Management, LLC.

границ | Эффективное производство биоактивного моноклонального антитела к бевацизумабу с использованием пептида саморасщепления 2А в каллусе трансгенного риса

Введение

Растения, включая все тело, определенные ткани или органы и суспензионные клетки растительного происхождения, считаются привлекательными и конкурентоспособными платформами для производства рекомбинантного белка.Было продемонстрировано, что по сравнению с Escherichia coli и клетками млекопитающих производственные системы на растительной основе имеют много преимуществ. Во-первых, производственные системы на основе растений более гибкие, а также более простые в эксплуатации, управлении и масштабировании, и, таким образом, могут в значительной степени снизить стоимость производства рекомбинантных белков. Во-вторых, растения, подобно клеткам млекопитающих, способны выполнять посттрансляционную модификацию рекомбинантных белков, такую ​​как гликозилирование, и, таким образом, можно избежать дополнительных затрат на модификации белка in vitro и (Frenzel et al., 2013; Сил и Джа, 2014; Колотилин и др., 2015). В-третьих, долгосрочное непрерывное производство рекомбинантных белков может быть реализовано на платформах растений, поскольку трансгены могут быть стабильно интегрированы в ядерный геном растений-хозяев, точно унаследованы и экспрессированы в более поздних поколениях. Кроме того, рекомбинантные белки растительного происхождения могут быть более безопасными, чем белки из E. coli или клеток млекопитающих, поскольку риск заражения патогенами человека, который всегда вызывает беспокойство при использовании клеток млекопитающих в качестве биореактора, может быть устранен с помощью растений. на базе производственных систем (Thie et al., 2008; Ни и Чен, 2009 г .; Merlin et al., 2014). Благодаря этим свойствам, различные биоактивные фармацевтические белки были продуцированы в растениях с момента первой экспрессии гормона роста человека в ткани трансгенного табака и каллюса подсолнечника (Barta et al., 1986) и экспрессии антител, вакцин, гормонов, факторов роста, и цитокины (De Muynck et al., 2010; Desai et al., 2010; Xu et al., 2011; Huang and McDonald, 2012).

Моноклональные антитела (mAb) представляют собой белковые комплексы, содержащие четыре субъединицы с двумя идентичными легкими цепями (LC) и двумя идентичными тяжелыми цепями (HC).MAb играют важную роль в биологических исследованиях, клинической диагностике, а в последнее время и в иммунотерапии различных заболеваний и рака (De Muynck et al., 2010). В отличие от других одноцепочечных рекомбинантных белков, производство mAb требует одновременной экспрессии двух генов, кодирующих как LC, так и HC, и правильной укладки четырех полипептидов, связанных дисульфидными связями. Открытие того факта, что растения могут эффективно экспрессировать и правильно собирать функциональные антитела (Hiatt et al., 1989), сделало растения альтернативной системой продуцирования антител, и с тех пор многие рекомбинантные антитела были продуцированы в различных растениях, включая мох (Decker and Reski, 2008), водоросли (Franklin, Mayfield, 2005) и высшие растения (Stoger et al., 2005; Де Муйнк и др., 2010; Сюй и др., 2011, 2012; Schillberg et al., 2013).

Ранее гены LC и HC mAb экспрессировались в двух разных кассетах экспрессии на одной области Т-ДНК вектора или экспрессировались отдельно в отдельных векторах, которые были котрансформированы в одно и то же растение, или экспрессировались в разных трансгенных растениях. которые были перекрестно оплодотворены для получения функционального антитела (De Muynck et al., 2010; Ko, 2014). Поскольку эти два гена экспрессируются отдельно, трудно контролировать их относительный уровень экспрессии, даже если используются идентичные регуляторные элементы.Фактически, в большинстве предыдущих отчетов приводились несбалансированные LC и HC как в трансгенных растениях, так и в клетках млекопитающих (Voss et al., 1995; Law et al., 2006; De Muynck et al., 2010; Chng et al., 2015). ). Различное соотношение LC: HC обычно неблагоприятно для сворачивания функциональных mAb и влияет как на уровень, так и на качество mAb (Schlatter et al., 2005; Law et al., 2006; Lee et al., 2009; Ho et al. ., 2013б). Использование внутреннего сайта входа в рибосому (IRES) для трансляции двух полипептидов (LC и HC) с одной мРНК также приводит к несбалансированной экспрессии из-за более низкой эффективности направленной IRES экспрессии гена вниз по течению с помощью механизма трансляции, независимого от кэпа (Hennecke et al. al., 2001; Ho et al., 2012, 2013а, б). Напротив, использование пептида 2A из вируса ящура Aphthovirus (FMDV) для высокой экспрессии mAb было зарегистрировано как в почках эмбриона человека 293, так и в клетках яичника китайского хомячка (CHO) (Fang et al. al., 2005; Chng et al., 2015), но об этой стратегии экспрессии mAb в системе трансгенных растений до сих пор не сообщалось.

Бевацизумаб представляет собой гуманизированное mAb, нацеленное на антиген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (Presta et al., 1997; Ferrara et al., 2005), который широко сверхэкспрессируется в различных солидных опухолях человека и играет ключевую роль в ангиогенезе опухоли (Ellis and Hicklin, 2008; Goel and Mercurio, 2013; Domigan et al., 2015). Бевацизумаб нейтрализует VEGF, предотвращает их взаимодействие с рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2 и, таким образом, блокирует передачу сигналов нижестоящих для ангиогенеза опухоли (Wang et al., 2004). Бевацизумаб является производным мышиного mAb A4.6.1 против VEGF. Оно имеет 93% человеческую и 7% мышиную последовательность и имеет биохимические и фармакологические свойства, аналогичные исходным мышиным mAb.Он нейтрализует все изоформы человеческого VEGF (hVEGF) с высокой аффинностью и ингибирует VEGF-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез опухоли, но с пониженной иммуногенностью и более длительным периодом полужизни по сравнению с мышиным антителом (Gerber and Ferrara, 2005). Он широко применяется в клинической практике метастатического колоректального рака, глиобластомы, немелкоклеточного рака легкого, метастатического рака почки, распространенного рака шейки матки, платинорезистентного рака яичников (Giantonio, 2006; Ali et al., 2008; Тонини и др., 2013; Тевари и др., 2014; Лю и Матулонис, 2015; Мейсон, 2015). Бевацизумаб (Авастин) одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для клинического применения в терапии рака (Bellmunt, 2007; Pal et al., 2014).

Хотя все больше данных свидетельствует о высокой эффективности бевацизумаба для лечения различных заболеваний, по-прежнему существуют некоторые препятствия, ограничивающие его широкое применение (Hayashi et al., 2014). Один из недостатков - дороговизна терапии, опосредованной бевацизумабом.Высокая стоимость бевацизумаба во многом зависит от его производства, которое зависит исключительно от экспрессионных систем млекопитающих (Makino et al., 2011; Spadiut et al., 2013).

В этом исследовании мы сообщили о первом растении, которое произвело бевацизумаб с использованием каллуса трансгенного риса в качестве системы экспрессии генов. Рис является одновременно основной культурой и модельным растением для биологических исследований из-за его небольшого генома и высокоэффективной системы трансформации генов. Считается, что семена риса и суспензионные культуры являются хорошими системами для производства многих ценных биоактивных белков (Kim et al., 2008; He et al., 2011; Kuo et al., 2013; Корбин и др., 2016; Fujiwara et al., 2016). Оптимизированные по кодонам гены LC и HC бевацизумаба были синтезированы в виде полипротеина с линкерным пептидом самоотщепления 2A из вируса ящура, клонированы в растительный бинарный вектор под конститутивным промотором убиквитина кукурузы и трансформированы в ядерный геном риса с помощью Agrobacterium . -опосредованная трансформация. Высокие уровни биологически функционального бевацизумаба были экспрессированы и очищены с помощью аффинной хроматографии.Иммуноферментный анализ (ELISA) связывания показал, что рис, экспрессирующий Бевацизумаб, и коммерческий Авастин имели сходную аффинность связывания с мишенью VEGF.

Материалы и методы

Растительные материалы

В данном исследовании использовали рис

( Oryza sativa, var. Japonica cv. Nipponbare). Зрелые здоровые семена Dehusk промывали водой Milli-Q, затем 70% (об. / Об.) Этанолом в течение 30 с, а затем погружали в 1,5% гипохлорит натрия на 30 мин при интенсивном встряхивании.После трехкратной промывки стерилизованной водой Milli-Q семена помещали в среду N6 (Chu et al., 1975) с добавлением 2 мг / л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (среда N6D) при 28 ° C в темноте. в течение 3 недель, чтобы вызвать каллус у зрелого эмбриона. Полученные каллусы пересевали каждые 3 недели и готовили для последующей трансформации, опосредованной Agrobacterium .

Построение завода Binary Vector

Пептидные последовательности LC и HC бевацизумаба были получены из базы данных DrugBank.Гены, кодирующие легкую цепь бевацизумаба (BLC) и тяжелую цепь бевацизумаба (BHC; GenBank, KX119516 и KX119517), были оптимизированы с помощью программного обеспечения онлайн-оптимизатора кодонов с использованием характеристик систематической ошибки использования кодонов риса на основе аминокислотных последовательностей бевацизумаба (рисунки 1А, Б). Сигнальный пептид удерживания эндоплазматического ретикулума (ER) (KDEL) был добавлен к C-концам как BLC, так и BHC для направленной экспрессии рекомбинантных белков в ER (рис. 1C).

РИСУНОК 1. Т-ДНК участков конструкций для трансформации риса. (A) конструкция pUNBHLC с генами бевацизумаба LC (BLC) и HC (BHC), экспрессируемыми в двух кассетах экспрессии; (B) конструкция pUNBevaHL с BLC и BHC, экспрессируемая в виде полипротеина, связанного с пептидом самоотщепления ящура 2A; (C) Конструкция pUNBevaHL-KDEL с BLC и BHC, экспрессировавшаяся как полипротеин, как в (B) , но последовательность удерживающего пептида KDEL ER была добавлена ​​к C-концам кодирующих областей обоих генов BLC и BHC.Лизогенический бульон (LB) и RB обозначают левую и правую границы области Т-ДНК бинарного вектора. TNos и T35S являются терминаторами гена нопалинсинтазы Agrobacterium и кассеты экспрессии 35S CaMV соответственно. 2А представляет собой пептид самоотщепления из вируса ящура, а KDEL представляет собой пептид сигнала удерживания ER. Два сайта расщепления рестрикционным ферментом Eco RI (E) указаны на конструкциях pUNBevaHL и pUNBevaHL-KDEL в (B , C) , и указаны фрагменты размером ~ 3 т.п.н., фланкированные двумя сайтами Eco RI.Полоски под конструкцией pUNBevaHL (B) показывают положения зондов HptII и BLC, используемых в саузерн-блот-анализе.

Чтобы сделать полипротеин BLC и BHC, последовательность 2A (QLLNFDLLKLAGDVESNPGP) из ящура (Donnelly et al., 2001) была вставлена ​​между BHC и BLC (рисунки 1B, C). Пептидный линкер GSG был вставлен непосредственно перед последовательностью 2A для повышения эффективности расщепления (Chng et al., 2015).

Все кодирующие последовательности были синтезированы и помещены под промотор убиквитина кукурузы и клонированы в растительный бинарный вектор pUN1390 с Pac I и Mlu I, чтобы получить pUNBevaHL и pUNBevaHL-KDEL (Фигуры 1B, C).pUNBevaHL-KDEL отличается от pUNBevaHL наличием последовательностей, удерживающих ER как на цепях BLC, так и на цепях BHC.

Трансформация растений

Опосредованную Agrobacterium трансформацию проводили на основе метода Nishimura et al. (2006). Рекомбинантные бинарные векторы были введены в штамм Agrobacterium EHA105 методом замораживания-оттаивания (Weigel and Glazebrook, 2006). Полученные агробактерии культивировали в жидкой среде лизогенного бульона (LB) с добавлением 50 мг / л канамицина и 50 мг / л рифампицина при 28 ° C при 220 об / мин перемешивания в течение ночи.Эти культуры центрифугировали и ресуспендировали в среде AAM (Nishimura et al., 2006), содержащей 100 мкМ ацетосирингона, для получения OD600 суспензии Agrobacterium в диапазоне 0,05–0,10 для трансформации риса. Вновь индуцированные каллусы риса сушили стерилизованной фильтровальной бумагой, выдерживали в культуре Agrobacterium в течение 15 минут при коротком перемешивании, снова сушили стерилизованной фильтровальной бумагой и, наконец, помещали в среду для совместного культивирования при 28 ° C в темноте на 3 дня. Затем полученные каллусы переносили на среду для селекции (среда N6D с добавлением 500 мг / л цефотаксима и 50 мг / л гигромицина B) и инкубировали при 28 ° C в темноте до появления устойчивых к гигромицину B каллусов.После трех циклов 3-недельного пересева на селекционную среду каллусы, устойчивые к гигромицину B, были подтверждены саузерн-блоттингом (дополнительный метод S1) и регенерированы в соответствии с методом Nishimura et al. (2006).

Вестерн-блот

Общий белок экстрагировали из каллусов дикого типа и выбранных трансгенных линий риса. Каллусы растирали пестиком в ступке в жидком азоте. Полученный мелкодисперсный порошок добавляли к равному объему экстракционного буфера (200 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 100 мМ NaCl, 400 мМ сахарозы, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА], 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,05% Твин 20), осторожно перемешивают и инкубируют на льду в течение 10 мин. Образцы дважды центрифугировали при 13000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C. Затем 25 мкг белковых экстрактов смешивали с загрузочным буфером додецилсульфата натрия (SDS), разделяли электрофорезом в 10% SDS полиакриламидном геле (PAGE) в восстанавливающих (кипячение в течение 5 минут с 5% 2-меркаптоэтанолом) или невосстанавливающих условиях. и иммуноблоттинг на мембране из поливинилидендифторида (Millipore Corporation, США).Мембрану блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре 3% (мас. / Об.) Бычьим сывороточным альбумином (BSA) в 1 × фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,1% (об. / Об.) Tween-20 (PBST, 137 мМ. NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na 2 HPO 3 , 1,5 мМ KH 2 PO 3 , pH 7,5) и зондировали в течение 2 часов при комнатной температуре конъюгированными с пероксидазой аффинирующими козьими антителами против IgG человека (LC + HC) антитело (ProteinTech Group, США), разведенное в блокирующем буфере [1 × PBST с 3% (мас. / Об.) BSA] в соотношении 1: 5000.Блоттированную мембрану трижды промывали 1 × PBST, и сигналы проявляли с использованием рентгеновской пленки FUJI Medical (Fujifilm, Япония). Коммерческое mAb к бевацизумабу от Roche (Avastin, Lot №: H0129; Roche Pharma, Switzerland) использовали в качестве положительного контроля.

Предполагая, что существует диапазон, в котором интенсивность изображения вестерн-блоттинга линейно пропорциональна концентрации белка, относительную экспрессию BLC и BHC можно определить путем анализа интенсивности изображения. Изображения вестерн-блоттинга анализировали с помощью программы ImageJ для определения плотности полос BLC и BHC каждой трансгенной линии.Отношение BLC: BHC рассчитывали путем деления плотности BLC на плотность BHC.

Биологическая активность бевацизумаба, полученного из риса

Биологические активности бевацизумаба, полученного из риса из каллуса трансгенного риса, определяли с помощью набора для ELISA Kit (SHIKARI Q-BEVA, Matriks Biotechnology Co. Ltd., Турция). Стандарты и образцы разбавляли в соотношении 1: 100 с использованием буфера для анализа, поставляемого в наборе, и инкубировали в микротитровальном планшете с предварительно нанесенным покрытием hVEGF при 25 ° C в течение 1 часа. После трехкратной промывки 1 × PBST меченный биотином hVEGF добавляли в микротитровальный планшет и инкубировали при 25 ° C в течение 1 часа.После 1 ч инкубации лунки трижды промывали 1 × PBST, а затем добавляли конъюгированную со стрептавидином пероксидазу хрена (HRP) и инкубировали при 25 ° C в течение 0,5 часа. Затем лунки трижды промывали 1 × PBST, и связанную ферментативную активность определяли путем добавления раствора субстрата TMB (3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин). После инкубации при 25 ° C в течение 20 минут реакцию субстрата останавливали добавлением стоп-раствора TMB в каждую лунку, и планшеты считывали при длине волны 450 нм в считывающем устройстве для микропланшетов (BioTek, США).

Количественное определение бевацизумаба, полученного из риса

Стандартная кривая была построена с использованием коммерческого бевацизумаба в концентрациях 0, 3, 10, 30 и 100 мкг / мл. Концентрацию mAb в мг / кг сырой массы (FW) в каждом образце трансгенного риса рассчитывали путем сравнения показания OD450 с полученной стандартной кривой для бевацизумаба. Для каждого образца были измерены три повтора, и данные были проанализированы статистически.

Очистка антител

Общие растворимые белки экстрагировали из 50 г каллусов двух трансгенных линий (UNBevaHL-3-15 и UNBevaHL-KDEL-5), как описано ранее.Экстрагированные белки фильтровали через фильтры 0,45 мкм и загружали на колонки HiTrap Protein A HP (GE Healthcare), предварительно уравновешенные связывающим буфером (0,02 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0). Для промывки колонок использовали пять объемов связывающего буфера, и mAb, связанные с белком A, элюировали элюирующим буфером (0,1 M глицин-HCl, pH 2,7), собирали в пробирки, содержащие одну пятую объема 1 M Tris– HCl (pH 9,0) довести до pH 7,0. Полученные mAb концентрировали ультрафильтрацией (отсечение молекулярной массы, 30 кДа, Millipore, США), количественно определяли с помощью ELISA, как описано ранее, а затем использовали для анализа активности связывания и гликозилирования.Чистоту mAb анализировали с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE с последующим окрашиванием кумасси синим.

Анализ аффинности связывания VEGF

Аффинность связывания очищенного бевацизумаба, полученного из риса, с его антигеном оценивали с помощью ELISA связывания антигена VEGF. Раствор антигена hVEGF (11066-HNAH, Sino Biological Inc, Пекин, Китай) в 1 × PBS (50 мкл, 0,5 мкг / мл) наносили на 96-луночные планшеты для микротитрования (Nunc ® Model No. 4-42404, Роскилле, Дания) в течение ночи при 4 ° C.Лунки промывали пять раз 200 мкл 1 × PBST между каждым этапом для полного удаления несвязавшегося материала. Лунки блокировали 200 мкл 1% БСА (мас. / Об.) В 1 × PBS при 25 ° C в течение 2 часов. Очищенные mAb серийно разводили до концентраций 0,0041–9,0 мкг / мл в 1 × PBS. Сто микролитров каждого разбавленного раствора загружали в лунки и инкубировали в течение 2 ч при 25 ° C. В качестве эталона использовали коммерческий бевацизумаб, в качестве отрицательного контроля использовали буфер 1 × PBS. После отмывки связанные антитела к VEGF инкубировали с 50 мкл 1% BSA в 1 × PBS, содержащем 1 мкг / мл конъюгированного с HRP козьего происхождения антитела против IgG человека (HC + LC) (ProteinTech Group, США).В каждую лунку добавляли сто микролитров раствора субстрата TMB, и реакцию останавливали после 20 мин инкубации при 25 ° C. Оптическую плотность при 450 нм считывали с помощью Microplate Reader (BioTek, США). Все образцы анализировали в трех экземплярах.

Анализ N-гликанов

Бевацизумаб, полученный из риса, очищали, как описано ранее, расщепляли трипсином и экстрагировали из кусочков геля в соответствии с Kolarich et al. (2006). Последующее фракционирование пептидов с помощью капиллярной обращенно-фазовой хроматографии и детектирование с помощью квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра Ultima Global (Waters) проводили в соответствии с Van Droogenbroeck et al.(2007). Данные масс-спектрометра триптических пептидов анализировали в сравнении с триптическим расщеплением in silico аминокислотной последовательности бевацизумаба с использованием программы Peptide Mass. На основе наборов данных по триптическим пептидам, наборы данных по триптическим гликопептидам были созданы путем добавления приращений массы гликана к массам идентифицированных гликопептидов.

Статистический анализ

Данные

ELISA подвергали одностороннему дисперсионному анализу с помощью OriginPro8 (Version8E, Origin Lab Corporation, MA, USA) и представляли как среднее значение ± стандартная ошибка трех повторов.

Результаты

Конструирование и экспрессия mAb к бевацизумабу в трансгенном рисе

Чтобы эффективно продуцировать рекомбинантные mAb, мы разработали две стратегии для экспрессии гена BLC и BHC . В одной конструкции гены BLC и BHC экспрессировались отдельно в двух кассетах экспрессии генов, обе управляемые промотором убиквитина кукурузы (рис. 1A). В другом дизайне BLC и BHC были экспрессированы как полипротеиновый ген, связанный пептидом самоотщепления FMDV 2A (Donnelly et al., 2001), которые могут подвергаться самообработке для высвобождения белков BLC и BHC (рис. 1B). Чтобы избежать специфичного для растений гликозилирования экспрессируемых белков, сигнал удерживания ER (KDEL) был добавлен к C-концам как белков BLC, так и BHC (рис. 1C).

Три конструкции были введены в ядерный геном риса посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium . Трансгенные каллусы отбирали на среде с добавлением гигромицина B на основании экспрессии гена селекционного маркера Hpt II.Стабильные трансгенные линии подтверждали анализом Саузерн-блоттинга с использованием полноразмерных BLC и hpt II в качестве зондов. Было подтверждено четырнадцать трансгенных событий и выявлено количество копий каждой трансгенной линии. Среди них четыре трансгенных линии имели единственную копию трансгена, шесть линий имели две копии, а остальные линии имели три или более копий (дополнительный рисунок S1). Трансгенные каллусы регенерировали с получением трансгенных растений риса, которые демонстрировали нормальные фенотипы, сходные с рисом дикого типа (дополнительный рисунок S2).

Отобранные трансгенные линии каллуса риса были дополнительно протестированы с помощью анализа SDS-PAGE для подтверждения экспрессии трансгена на уровне белка (фиг. 2). Все протестированные трансгенные линии продуцировали как белки BLC, так и BHC (рисунки 2A, B). Трансгенные линии с трансгенами, экспрессируемыми в двух кассетах экспрессии (фиг. 2A), продуцировали различные уровни BLC (~ 25 кДа) и BHC (~ 50 кДа), и в большинстве линий сигналы экспрессированного BLC были сильнее, чем BHC. Соотношение BLC к BHC в разных трансгенных линиях было от 0.От 95 до 19,2 со средним значением 4,32 (дополнительная таблица S1), что указывает на несбалансированную экспрессию белков BLC и BHC. Таким образом, дальнейший анализ трансгенных линий с этой конструкцией не проводился.

РИСУНОК 2. Вестерн-блоттинг экспрессии BHC, BLC и mAb бевацизумаба в каллусе трансгенного риса. mAb против BLC, BHC и бевацизумаба детектировали с помощью козьего антитела против человеческого IgG (LC и HC) в восстанавливающих условиях (A, B) и невосстанавливающих условиях (C) . (A) BHC и BLC были экспрессированы из кассет экспрессии различных генов, (B, C), BHC и BLC были экспрессированы в виде полипротеина, разделенного пептидом 2A. ПК представляет собой положительный контроль с коммерческим mAb против бевацизумаба; NC представляет собой отрицательный контроль с общими растворимыми белками из нетрансформированного каллуса; дорожки 1-8 в (A) , 1-5 и 6-9 в (B, C) представляют собой общие растворимые белки из различных трансгенных объектов, трансформированных pUNBHLC, pUNBevaHL и pUNBevaHL-KDEL, соответственно.Молекулярные массы белков указаны в левой части каждой панели. BHC (50 кДа), BLC (25 кДа) и mAb (150 кДа) указаны с правой стороны каждой панели.

Напротив, BLC и BHC в большинстве трансгенных линий с пептидными конструкциями 2A были пропорциональными, хотя наблюдались вариации в уровнях экспрессии среди различных трансгенных объектов. Соотношение BLC: BHC из разных трансгенных линий составляло от 0,11 до 1,90 при среднем 0,99, что аналогично соотношению в коммерческом образце бевацизумаба (Авастин) (0.99) (дополнительная таблица S1), что указывает на то, что примерно равные молекулы пептидов BLC и BHC были получены путем саморасщепления пептидного линкера 2A (рис. 2B). Во всех трансгенных линиях было только две основные полосы BLC ~ 25 кДа и BHC ~ 50 кДа, что указывает на то, что саморасщепление пептида 2A было полным и большая часть экспрессированного белка была интактной с небольшой деградацией.

Чтобы выяснить, правильно ли экспрессированные BLC и BHC собрались в тетрамеры mAb, был проведен невосстанавливающий SDS-PAGE, который не разрушал дисульфидные связи антитела (рис. 2C).Пять трансгенных линий, трансформированных pUNBevaHL, и четыре линии pUNBevaHL-KDEL, экспрессировали сравнимые уровни mAb с молекулярной массой около 150 кДа, аналогичные положительному контролю коммерческого бевацизумаба. Во всех трансгенных линиях была только одна полоса ∼150 кДа mAb, что указывает на отсутствие деградации белка.

Биологическая активность и количественная оценка полученных из риса mAb бевацизумаба

Обнаружение того, что каллус трансгенного риса может продуцировать правильно собранные тетрамеры mAb, указывает на то, что mAb, экспрессируемое этим растением, может быть функциональным.Биологическая активность бевацизумаба, полученного из риса, была обнаружена с помощью ELISA, анализа, основанного на высокоспецифическом взаимодействии антиген-антитело. Взаимодействия бевацизумаба, экспрессированного рисом, с hVEGF были подтверждены во всех четырех тестируемых трансгенных линиях, аналогично положительному контролю, но не было обнаружено взаимодействия, когда нетрансгенный рис использовали в качестве отрицательного контроля (рис. 3А).

РИСУНОК 3. Функциональный анализ растений, экспрессирующих mAb бевацизумаба, и определение уровней экспрессии в трансгенных растениях с помощью ELISA. (A) Активность связывания бевацизумаба, полученного из риса, с антигеном hVEGF определяли с помощью ELISA с положительным контролем коммерческого mAb бевацизумаба и отрицательным контролем нетрансформированных растений. Две трансгенные линии от растений, трансформированных pUNBevaHL и pUNBevaHL-KDEL, анализировали в трех повторностях. (B) Стандартная кривая бевацизумаба. (C) Уровни экспрессии mAb в трансгенных растениях. Эксперимент проводили в трех повторностях, и средние значения и ошибки содержания mAb в различных трансгенных растениях были представлены на графике.

Количественную оценку mAb проводили путем сравнения показаний OD450 для каждого образца со стандартной кривой, полученной с помощью коммерческого стандарта бевацизумаба (Авастин) (рис. 3В). Содержание бевацизумаба в четырех выбранных трансгенных линиях составляло от 160,7 до 242,8 мг / кг сырой массы (рис. 3С).

Экстракция и очистка mAb, экспрессированных в каллусе трансгенного риса

МА из двух трансгенных линий (UNBevaHL-3-15 и UNBevaHL-KDEL-5) очищали с помощью аффинной хроматографии на протеине А из 50 г каллусного материала каждой трансгенной линии.135,1 и 101,1 мг / кг FW mAb были выделены из двух трансгенных линий, что соответствует степени восстановления 55,6 и 59,8%, соответственно (таблица 1). Чистоту mAb определяли путем анализа очищенных образцов на SDS-PAGE, который показал в основном полосу mAb ~ 150 кДа. Однако при загрузке 5 мкг белков (дорожки 1 и 2) наблюдались слабые полосы с более низкой молекулярной массой (Фиг.4).

ТАБЛИЦА 1. Выделение mAb бевацизумаба, экспрессированных в каллусе трансгенного риса.

РИСУНОК 4. SDS-PAGE очищенного mAb бевацизумаба в трансгенном рисе. 5 мкг (дорожка 1), 2 мкг (дорожка 3) и 1 мкг (дорожка 5) mAb, очищенных от каллуса риса, трансформированного pUNBevaHL, 5 мкг (дорожка 2), 2 мкг (дорожка 4) и 1 мкг (дорожка 6 ) mAb, очищенные из каллуса риса, трансформированного pUNBevaHL-KDEL, и 0,5 мкг коммерческих mAb бевацизумаба (дорожка 7) анализировали невосстанавливающим SDS-PAGE и окрашивали кумасси синим. Была указана основная полоса мАт 150 кДа.

Определение аффинности бевацизумаба, полученного из риса, с помощью ELISA

Для сравнения аффинности связывания mAb, полученных из риса, с коммерческим бевацизумабом, с VEGF, ELISA выполняли с двумя mAb с сигналом удерживания KDEL ER, очищенным от каллуса риса, и без него (таблица 1) и коммерческим контролем бевацизумаба.Как показано на фиг. 5, не было значительного различия в аффинности связывания между двумя бевацизумабом, полученным из каллуса риса с сигнальным пептидом KDEL или без него, и не было обнаружено значительного различия между mAb, полученными из риса, и коммерческим бевацизумабом.

РИСУНОК 5. Активность связывания бевацизумаба с VEGF, измеренная с помощью ELISA. Очищенные моноклональные антитела бевацизумаба из каллуса трансгенного риса с конструкцией pBevaHL-KDEL (зеленый квадрат) и конструкцией pBevaHL (красный ромб), коммерческим бевацизумабом (синий треугольник, положительный контроль) и буфером 1 × PBS без бевацизумаба (фиолетовая точка, отрицательный результат). контроль) анализировали с помощью ELISA на активность связывания с hVEGF.Каждое измерение проводили в трех экземплярах.

Анализ N-гликанов бевацизумаба, полученного из риса

Триптически расщепленные гликопептиды из двух mAb бевацизумаба, полученных из риса, различающихся сигнальным пептидом удерживания KDEL ER, анализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии (таблица 2; дополнительный рисунок S3). Оба mAb имели высокий процент специфичного для растений гликозилирования β1, 2-ксилозой и α1, 3-фукозой. Общий процент специфического для растений гликозилирования, включая MMXF (M3Gn2X1F1), GnMXF (M3Gn3X1F1) и GnGnXF (M3Gn4X1F1), составил 56.7% для mAb без пептида KDEL и 46,8% для mAb с KDEL. Другие формы гликозилирования, включая типы с высоким содержанием маннозы, Man3 (M3Gn2), Man4 (M4Gn2), Man5 (M5Gn2), Man6 (M6Gn2), Man7 (M7Gn2), Man8 (M8Gn2) и Man9 (M9Gn2), пауциманнозид, а также гликанозид. негликозилирование также наблюдалось в обоих mAb, продуцируемых в каллюсе трансгенного риса.

ТАБЛИЦА 2. Масс-спектрометрический анализ гликопептидов из очищенных mAb после триптического расщепления.

Обсуждение

В этом отчете мы разработали и экспрессировали биологически функциональное mAb (бевацизумаб) в каллусе трансгенного риса.Система экспрессии растений имеет множество преимуществ, включая высокую производительность, простоту управления и масштабирования, безопасность и низкую стоимость. Чтобы максимизировать пользу системы экспрессии растений, было разработано множество стратегий для улучшения экспрессии и увеличения продукции. Например, трансгены можно стабильно интегрировать в ядерный геном или временно экспрессировать с использованием вирусных векторов или векторов Agrobacterium (Vaquero et al., 1999; Kathuria et al., 2002; Rodriguez et al., 2005; Sainsbury et al., 2008; Виллани и др., 2009). Кроме того, стабильная экспрессия в клеточных культурах может производить однородные рекомбинантные белки в контролируемой среде с использованием биореакторов, так что можно применять надлежащую производственную практику (GMP) (Shih and Doran, 2009; Xu et al., 2011; Huang and McDonald, 2012). . В этом исследовании мы произвели биоактивный бевацизумаб в стабильно трансформированных каллусах риса, и содержание бевацизумаба, полученного из риса, достигло 242,8 мг / кг FW (рис. 4). С развитием системы культивирования рисовой суспензии можно расширить производство для достижения крупномасштабного производства за счет использования технологии биореактора, такой как непрерывная или полунепрерывная производственная система, чтобы сократить время производства и стоимость производства (Tekoah et al. al., 2015; Ян и др., 2015; Corbin et al., 2016).

Полное mAb состоит из двух идентичных LC и HC, связанных дисульфидными связями. На низкий уровень экспрессии mAb в предыдущих отчетах в основном влияли стратегии экспрессии. Несбалансированная экспрессия LC и HC была неизбежна в предыдущих системах, когда два гена, кодирующие LC и HC, экспрессировались отдельно или экспрессировались в одной бицистронной мРНК отдельно с помощью IRES, поскольку нижележащая открытая рамка считывания (ORF) экспрессировалась только в ∼10% уровня верхнего течения (Minskaia, Ryan, 2013; Minskaia et al., 2013). Несбалансированная экспрессия LC и HC неблагоприятна для выхода и качества продукции mAb, поскольку для эффективной сборки и модификации mAb, по-видимому, требуется оптимальное соотношение LC и HC (Schlatter et al., 2005; Ho et al., 2013b; Chng et al. др., 2015). Однако были получены противоречивые результаты об оптимальном соотношении LC и HC в производстве рекомбинантных mAb. Считалось, что избыточная экспрессия LC благоприятна для продукции mAb, поскольку избыток LC позволит более эффективно сворачивать, собирать и удалять HC, который при избыточной экспрессии склонен к агрегации (Vanhove et al., 2001; Ли и др., 2009). Ho et al. (2013b) сообщили о более высоких титрах продуцирования mAb при соотношении LC: HC 3,43. Аналогичным образом Schlatter et al. (2005) наблюдали эффективное продуцирование трех mAb с соотношениями LC: HC пептид 2, 2,5 и 3,1 в клетках CHO. Напротив, отдельные группы также сообщили, что избыточный HC благоприятен для экспрессии IgG (Jiang et al., 2006; Fallot et al., 2009). Однако избыточная экспрессия LC или HC продуцировала диммерные и мономерные молекулы LC или HC помимо LC 2 HC 2 mAb (Ho et al., 2013б). В отличие от других систем, использование саморасщепляющегося пептида 2A может обеспечить одинаковую молярную экспрессию пептидов LC и HC, чтобы избежать несбалансированной экспрессии и, таким образом, продуцировать высокие уровни mAb (Chng et al., 2015).

Геном РНК вируса ящура содержит единственную ORF, которая кодирует полипротеин. Пептид FMDV 2A между областями 2A и 2B полипротеина саморасщепляется с образованием вирусных белков 2A и 2B (Ryan et al., 1991). Саморасщепление пептида 2A является ко-трансляционным с помощью механизма перекодирования «Stop-Go» или «Stop-carry on», при котором трансляция вышестоящего белка приостанавливается последовательностью 2A, а остов пептида разрывается между двумя последними. аминокислоты, глицин (G) и пролин (P) пептида 2A (Atkins et al., 2007; Доронина и др., 2008; Шарма и др., 2011). Пептид 2A также управляет трансляционным кодированием нижестоящего белка. В отличие от других систем, опосредованное пептидом 2А расщепление не зависит от клеточных факторов в разных типах клеток, поскольку активность саморасщепления зависит только от рибосом, которые структурно консервативны среди всех эукариотических организмов. Таким образом, пептид 2A активен во всех эукариотических системах и широко используется в качестве инструмента совместной экспрессии при экспрессии двух или более белков (Donnelly et al., 2001; де Фелипе и др., 2006). Недавно пептид 2A был применен для стабильной и высокой экспрессии mAb в клетках CHO и мышах, и было сочтено, что он имеет потенциальное применение in vivo для доставки mAb в генной терапии (Fang et al., 2005; Chng et al. , 2015). Пептид 2A также применяли для получения одноцепочечных антител в растениях (Smolenska et al., 1998). Однако до сих пор не сообщалось о применении 2A для получения полных mAb в растениях.

Мы сообщили об экспрессии mAb (бевацизумаб) LC и HC в виде полипротеина с линкером 2A из ящура в одной кассете экспрессии гена, управляемой сильным конститутивным промотором убиквитина в каллусе трансгенного риса.Были получены высокие уровни функциональных антител (рис. 3). Мы достигли экспрессии более 200 мг / кг FW mAb бевацизумаба в трансгенных клетках риса, что было выше, чем у большинства известных систем экспрессии рекомбинантных mAb (Gomord et al., 2004; Girard et al., 2006; Villani et al. ., 2009; De Muynck et al., 2010; Madeira et al., 2015). Высокий уровень экспрессии можно объяснить следующими факторами. Во-первых, оптимизация кодонов делает мРНК стабильной, а трансляцию белка - эффективной.Во-вторых, сильный конститутивный промотор убиквитина увеличивает уровень транскрипции трансгена. В-третьих, однокопия трансгена, опосредованного Agrobacterium -опосредованной трансформацией, снижает шансы подавления гена. И последнее, но не менее важное: экспрессия полипротеина с использованием самопроцессирующегося пептида 2A способствует накоплению функционального mAb. Использование системы экспрессии пептида 2А может влиять на выход mAb следующими способами. Во-первых, саморасщепление 2A-связанного полипротеина дает равные молекулы HC и LC, что может быть оптимальным соотношением для накопления mAb.Вестерн-блоттинг показал, что LC и HC бевацизумаба, экспрессируемого с полипептидом 2A, были на аналогичных уровнях в большинстве трансгенных линий, но наблюдалась несбалансированная экспрессия LC и HC, когда они находились на разных кассетах экспрессии (фиг.3). Хотя избыток LC или HC может ускорить сборку mAb, как показано в математическом моделировании (Gonzalez et al., 2002), соотношение LC: HC 1: 1 более экономично, поскольку IgG mAb имеют равное количество LC и HC. субъединицы. Во-вторых, саморасщепление является ко-трансляционным, так что и LC, и HC одновременно продуцируются и мобилизуются в ER, где mAb можно немедленно собрать и свернуть.В-третьих, правильная и полная сборка mAb может снизить протеолитическую деградацию LC или HC мономеров или диммеров, если они присутствуют в избытке, поскольку неправильно или не полностью свернутые антитела чувствительны к протеазной атаке (Gardner et al., 1993). Посттрансляционная деградация белка - обычное явление, которое существенно влияет на выход продукции чужеродного белка (Doran, 2006; De Muynck et al., 2010; Desai et al., 2010; Xu et al., 2011; Hehle et al. , 2016). Но в наших исследованиях, основанных на результатах вестерн-блоттинга, разрушения mAb не наблюдалось.Вероятно, это происходит из-за правильной и полной сборки mAb из субъединиц LC и HC, полученных из саморасщепляющегося полипротеина 2A (рис. 2C). Слабые полосы с более низкой молекулярной массой, наблюдаемые на рисунке 4, вероятно, были продуктами разложения во время процесса экстракции и очистки белка, поскольку такие полосы не наблюдались до этого процесса (рисунок 2C).

Гликозилирование является важным свойством рекомбинантного mAb, которое влияет на его аффинность связывания и период полужизни, а также вызывает иммуногенность (Saint-Jore-Dupas et al., 2007; Реуш и Техада, 2015). Было показано, что белки, экспрессируемые в растениях, модифицируются иначе, чем в системах млекопитающих. Специфическое для растений гликозилирование, включая β 1,2-ксилозу и ядро ​​α 1,3-фукозы, происходит в аппарате Гольджи. Чтобы избежать специфичного для растений гликозилирования, обычно используются две стратегии: удержание рекомбинантного белка в ER с помощью сигнального пептида удерживания ER или для нокаута генов растений, кодирующих специфические для растений ферменты гликозилирования, с помощью гликозилирования (Strasser et al., 2008, 2014; Кастильо и Стейнкелльнер, 2012; Castilho et al., 2014; Курогочи и др., 2015). В этом отчете мы пытались нацелить как HC, так и LC на ER, добавляя сигнальные пептиды KDEL на C-концах, но безуспешно предотвращали специфичное для растений гликозилирование (таблица 2), что указывает на то, что сигналы KDEL не функционировали должным образом. . Одна из причин этой неисправности сигнала KDEL может быть связана с результатами самообработки пептидного линкера 2A между HC и LC. Сообщалось, что расщепление пептида 2А между двумя последними аминокислотами, глицином (G) и пролином (P), привело бы к добавлению пептида GSGQLLNFDLLKLAGDVESNPG к C-концу вышележащего белка и аминокислотного остатка P. к N-концу нижележащего (Chng et al., 2015). В нашей конструкции (рис. 1) добавление пептида 2A к C-концу HC приведет к отмене сигнала KDEL, который функционирует только тогда, когда он присутствует на C-конце белка. Потеря сигнала KDEL в вышестоящем белке может быть решена путем добавления сайта распознавания фурин-протеазы перед 2А, который удалит остатки пептида 2А (Chng et al., 2015). Хотя эта стратегия может решить проблему удержания ER в будущих исследованиях, удержание рекомбинантных mAb в ER с сигналом KDEL будет ограничивать секрецию белка и неизменно увеличивать стоимость последующего процесса.Таким образом, альтернативный подход с помощью гликоинженерии, чтобы замолчать или нокаутировать специфичные для растений гены гликозилирования и ввести гены гликозилирования млекопитающих в растения, может быть лучшим решением (Strasser et al., 2008, 2014; Castilho and Steinkellner, 2012).

Гликозилирование влияет на антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) рекомбинантных mAb. Например, было продемонстрировано, что свободные от фукозы mAb (13F6), продуцируемые в гликоинженерных табаках, обладают более высоким сродством связывания с Fc γ R и повышенной эффективностью против вируса Эбола (Zeitlin et al., 2011). Однако бевацизумаб действует через связывание и нейтрализацию секретируемого VEGF, но не имеет ADCC (Wang et al., 2004). Биологическую активность мАт бевацизумаба, полученного из риса (включая меченые и немеченые KDEL), анализировали с помощью анализа связывания на основе ELISA с его антигеном hVEGF (фиг. 5). Не наблюдали значительных различий между двумя mAb, экспрессируемыми в рисе, и между mAb, экспрессируемыми в рисе, и коммерческим контролем бевацизумаба, что указывает на то, что экспрессированные в рисе mAb к бевацизумабу являются функциональными.Остается неизвестным, обладают ли мАт бевацизумаба, экспрессируемые рисом, другими сопоставимыми свойствами, такими как нейтрализация hVEGF in vivo , период полужизни в клинических исследованиях и, что наиболее важно, неблагоприятная иммуногенность, связанная с экспрессируемыми растениями рекомбинантными белками, которые должны быть устранены. охарактеризован в будущих исследованиях.

В заключение мы сообщили об эффективной системе экспрессии рекомбинантных mAb в каллусе трансгенного риса с использованием пептида самоотщепления ящура 2A. Расщепление полипротеина, связанного с пептидом 2A, в одной кассете экспрессии гена дает равные молекулы HC и LC mAb, обеспечивает эффективную сборку и укладку функционального антитела и дает рекомбинантное mAb на высоких уровнях.

Авторские взносы

WY и DL разработали, спроектировали и руководили исследованием, обсудили результаты и написали рукопись. LC и XY провели эксперименты, проанализировали данные и написали рукопись. Все авторы одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Эта работа частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (проект № 31271422), Проектом инновационной группы Shenzhen Peacock (№ KQTD201101), Фондом исследовательской группы инноваций Гуандуна (2014ZT05S078) и Фондом естественных наук провинции Гуандун (проект Нет.2015A030310421).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Максвелла Ю из средней школы Роквуд Саммит штата Миссури, США, за редактирование рукописи. Все материалы, полученные в результате этого исследования, будут доступны по запросу.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01156

Сноски

  1. http://www.avastin.com/patient
  2. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00112
  3. http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/
  4. http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=311553
  5. https://imagej.nih.gov/ij/index.html
  6. http://www.expasy.org/tools/peptide-mass.html

Список литературы

Али, С.A., McHayleh, W.M., Ahmad, A., Sehgal, R., Braffet, M., Rahman, M., et al. (2008). Терапия бевацизумабом и иринотеканом при мультиформной глиобластоме: серия из 13 случаев. J. Neurosurg. 109, 268–272. DOI: 10.3171 / JNS / 2008/109/8/0268

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аткинс, Дж. Ф., Уиллс, Н. М., Лофран, Г., Ву, К. Ю., Парсавар, К., Райан, М. Д. и др. (2007). Случай для «StopGo»: перепрограммирование трансляции для увеличения кодонного значения GGN путем стимулирования нетрадиционной терминации (Stop) после добавления глицина и последующего продолжения трансляции (Go). РНК 13, 803–810. DOI: 10.1261 / rna.487907

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барта, А., Зоммергрубер, К., Томпсон, Д., Хартмут, К., Мацке, М. А., и Мацке, А. Дж. (1986). Экспрессия нопалинсинтазы - химерного гена гормона роста человека в трансформированной ткани каллюса табака и подсолнечника. Plant Mol. Биол. 6, 347–357. DOI: 10.1007 / BF00034942

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беллмант, Дж. (2007).Текущее лечение распространенной почечно-клеточной карциномы (ПКР): влияние таргетной терапии на лечение ПКР. Eur. Урол. Дополнение 6, 484–491. DOI: 10.1016 / j.eursup.2007.01.018

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кастильо, А., Стейнкелльнер, Х. (2012). Гликоинженерия на заводах для создания человеческих структур N-гликана. Biotechnol. J. 7, 1088–1098. DOI: 10.1002 / biot.201200032

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кастильо, А., Windwarder, M., Gattinger, P., Mach, L., Strasser, R., Altmann, F., et al. (2014). Протеолитический и N-гликановый процессинг человеческого альфа-1-антитрипсина, экспрессируемого в Nicotiana benthamiana . Plant Physiol. 166, 1839–1851. DOI: 10.1104 / стр.114.250720

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chng, J., Wang, T., Nian, R., Lau, A., Hoi, K.M, Ho, S.C., et al. (2015). Эффективное расщепление пептидов 2А для высокой экспрессии моноклональных антител в клетках СНО. MAbs 7, 403–412. DOI: 10.1080 / 19420862.2015.1008351

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chu, C. C., Wang, C. C., Sun, C. S., Hsu, K. C., Yen, K. C., Chu, C. Y., et al. (1975). Создание эффективной среды для выращивания пыльников риса путем сравнительных экспериментов с источником азота. Sci. Грех. 13, 659–668.

Корбин, Дж. М., Хашимото, Б. И., Каруппанан, К., Кайзер, З. Р., Ву, Л., Робертс, Б. А. и др. (2016). Полунепрерывное биореакторное производство рекомбинантной бутирилхолинэстеразы в суспензионных культурах трансгенных клеток риса. Перед. Plant Sci. 7: 412. DOI: 10.3389 / fpls.2016.00412

CrossRef Полный текст | Google Scholar

де Фелипе, П., Люк, Г. А., Хьюз, Л. Е., Гани, Д., Халпин, К., и Райан, М. Д. (2006). E unum pluribus: множественные белки из самоперерабатывающегося полипротеина. Trends Biotechnol. 24, 68–75. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2005.12.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де Муйнк, Б., Наварра, К., и Бутри, М. (2010). Производство антител в растениях: состояние через двадцать лет. Plant Biotechnol. J. 8, 529–563. DOI: 10.1111 / j.1467-7652.2009.00494.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Декер, Э. Л., Рески, Р. (2008). Современные достижения в производстве сложных биофармацевтических препаратов с биореакторами из мха. Биопроцесс Биосист. Англ. 31, 3–9. DOI: 10.1007 / s00449-007-0151-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Десаи П. Н., Шривастава Н. и Пад Х. (2010). Производство гетерологичных белков в растениях: стратегии оптимальной экспрессии. Biotechnol. Adv. 28, 427–435. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2010.01.005

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Домиган, К. К., Зияд, С., Ируэла-Ариспе, М. Л. (2015). Канонические и неканонические пути факторов роста эндотелия сосудов: новые разработки в биологии и передаче сигналов. Артериосклер. Тромб. Васк. Биол. 35, 30–39. DOI: 10.1161 / ATVBAHA.114.303215

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доннелли, М.Л., Хьюз, Л. Е., Люк, Г., Мендоса, Х., тен Дам, Э., Гани, Д. и др. (2001). Активность «расщепления» сайт-направленных мутантов вируса ящура 2A и встречающихся в природе «2A-подобных» последовательностей. J. Gen. Virol. 82, 1027–1041. DOI: 10.1099 / 0022-1317-82-5-1027

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доран, П. М. (2006). Деградация чужеродных белков и нестабильность в растениях и тканевых культурах растений. Trends Biotechnol. 24, 426–432. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2006.06.012

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доронина В. А., Ву К., де Фелипе П., Сакс М. С., Райан М. Д. и Браун Дж. Д. (2008). Сайт-специфическое высвобождение растущих цепей из рибосом по смысловому кодону. Мол. Cell. Биол. 28, 4227–4239. DOI: 10.1128 / MCB.00421-08

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эллис, Л. М., и Хиклин, Д. Дж. (2008). VEGF-таргетная терапия: механизмы противоопухолевого действия. Нат.Rev. Cancer 8, 579–591. DOI: 10.1038 / nrc2403

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фалло, С., Бен Найя, Р., Хиблот, К., Мондон, П., Ляказетт, Э., Буаяди, К. и др. (2009). Бицистронные векторы на основе альтернативного сплайсинга для экспрессии белков с регулируемым соотношением и применения для получения рекомбинантных антител. Nucleic Acids Res. 37: e134. DOI: 10.1093 / nar / gkp716

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фанг, Дж., Цянь, Дж.J., Yi, S., Harding, T.C., Tu, G.H., VanRoey, M., et al. (2005). Стабильная экспрессия антител на терапевтических уровнях с использованием пептида 2А. Нат. Biotechnol. 23, 584–590. DOI: 10.1038 / nbt1087

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Феррара, Н., Хиллан, К. Дж., И Новотны, В. (2005). Бевацизумаб (Авастин), гуманизированное моноклональное антитело против VEGF для лечения рака. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 333, 328–335. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2005.05.132

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франклин, С.Э. и Мэйфилд С. П. (2005). Последние разработки в области производства терапевтических белков человека в эукариотических водорослях. Мнение эксперта. Биол. Ther. 5, 225–235. DOI: 10.1517 / 14712598.5.2.225

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Френцель А., Хуст М. и Ширрманн Т. (2013). Экспрессия рекомбинантных антител. Перед. Иммунол. 4: 217. DOI: 10.3389 / fimmu.2013.00217

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fujiwara, Y., Ян, Л., Такайва, Ф., Секикава, К. (2016). Экспрессия и очистка рекомбинантных интерлейкинов-4 и -6 мыши из семян трансгенного риса. Мол. Biotechnol. 58, 223–231. DOI: 10.1007 / s12033-016-9920-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарднер А. М., Авиель С. и Аргон Ю. (1993). Быстрая деградация несобранной легкой цепи иммуноглобулина опосредуется сериновой протеазой и происходит в компартменте до Гольджи. J. Biol. Chem. 268, 25940–25947.

Google Scholar

Гербер, Х. П. и Феррара, Н. (2005). Фармакология и фармакодинамика бевацизумаба в качестве монотерапии или в комбинации с цитотоксической терапией в доклинических исследованиях. Cancer Res. 65, 671–680.

Google Scholar

Джантонио, Б. Дж. (2006). Бевацизумаб в лечении метастатического колоректального рака (мКРР) в условиях второй и третьей линии. Семин. Онкол. 33, S15 – S18. DOI: 10.1053 / j.seminoncol.2006.08.003

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Жирар, Л. С., Фабис, М. Дж., Бастин, М., Куртуа, Д., Петьяр, В., и Копровски, Х. (2006). Экспрессия моноклональных антител человека против вируса бешенства в культуре клеток табака. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 345, 602–607. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2006.03.219

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gomord, V., Sourrouille, C., Fitchette, A.C., Bardor, M., Pagny, S., Lerouge, P., et al. (2004).Производство и гликозилирование фармацевтических препаратов растительного происхождения: антитела как проблема. Plant Biotechnol. J. 2, 83–100. DOI: 10.1111 / j.1467-7652.2004.00062.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гонсалес Р., Эндрюс Б. А. и Асенхо Дж. А. (2002). Кинетическая модель BiP- и PDI-опосредованного сворачивания и сборки белка. J. Theor. Биол. 214, 529–537. DOI: 10.1006 / jtbi.2001.2478

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаяси, Х., Арао, Т., Мацумото, К., Кимура, Х., Тогаши, Ю., Хирасима, Ю., и др. (2014). Биомаркеры реактивной резистентности и раннего прогрессирования заболевания во время химиотерапии и лечения колоректальной карциномой бевацизумабом. Oncotarget 5, 2588–2595. DOI: 10.18632 / oncotarget.1811

CrossRef Полный текст | Google Scholar

He, Y., Ning, T., Xie, T., Qiu, Q., Zhang, L., Sun, Y., et al. (2011). Крупномасштабное производство функционального сывороточного альбумина человека из семян трансгенного риса. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108, 19078–19083. DOI: 10.1073 / pnas.1109736108

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хеле, В. К., Пол, М. Дж., Робертс, В. А., ван Доллеверд, К. Дж., И Ма, Дж. К. (2016). Направленный на сайт мутагенез для стабилизации рекомбинантных моноклональных антител, экспрессируемых в растениях табака ( Nicotiana tabacum ). FASEB J. 30, 1590–1598. DOI: 10.1096 / fj.15-283226

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хеннеке, М., Kwissa, M., Metzger, K., Oumard, A., Kroger, A., Schirmbeck, R., et al. (2001). Состав и расположение генов определяют силу управляемой IRES трансляции в бицистронных мРНК. Nucleic Acids Res. 29, 3327–3334. DOI: 10.1093 / nar / 29.16.3327

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hiatt, A., Cafferkey, R., and Bowdish, K. (1989). Продукция антител в трансгенных растениях. Природа 342, 76–78. DOI: 10.1038 / 342076a0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хо, С.К., Бардор, М., Фенг, Х., Мариати, Тонг, Ю. У., Сонг, З. и др. (2012). IRES-опосредованные трицистронные векторы для усиления генерации высокомоноклональных антител, экспрессирующих клеточные линии СНО. J. Biotechnol. 157, 130–139. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2011.09.023

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хо, С. К., Бардор, М., Ли, Б., Ли, Дж. Дж., Сонг, З., Тонг, Ю. В. и др. (2013a). Сравнение внутреннего сайта входа в рибосомы (IRES) и Furin-2A (F2A) для уровня и качества экспрессии моноклональных антител в клетках CHO. PLoS ONE 8: e63247. DOI: 10.1371 / journal.pone.0063247

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хо, С. К., Кох, Э. Ю., ван Бирс, М., Мюллер, М., Ван, К., Тео, Г. и др. (2013b). Контроль соотношения lgG LC: HC в стабильно трансфицированных клетках CHO и изучение влияния на экспрессию, агрегацию, гликозилирование и конформационную стабильность. J. Biotechnol. 165, 157–166. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2013.03.019

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг Т.К., и Макдональд, К. А. (2012). Биореакторные системы для производства чужеродных белков in vitro с использованием культур клеток растений. Biotechnol. Adv. 30, 398–409. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2011.07.016

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзян З., Хуанг Ю. и Шарфштейн С. Т. (2006). Регулирование производства рекомбинантных моноклональных антител в клетках яичников китайского хомячка: сравнительное исследование количества копий гена, уровня мРНК и экспрессии белка. Biotechnol.Прог. 22, 313–318. DOI: 10.1021 / bp0501524

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Катурия, С., Шрираман, Р., Нат, Р., Сак, М., Пал, Р., Арцаенко, О. и др. (2002). Эффективность рекомбинантных антител против ХГЧ. Гум. Репрод. 17, 2054–2061. DOI: 10.1093 / humrep / 17.8.2054

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Т. Г., Бэк, М. Ю., Ли, Э. К., Квон, Т. Х., Янг, М. С. (2008). Экспрессия гормона роста человека в суспензионной культуре трансгенных клеток риса. Rep. Растительных клеток 27, 885–891. DOI: 10.1007 / s00299-008-0514-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ко, К. (2014). Экспрессия рекомбинантных вакцин и антител в растениях. Моноклон. Antib. Иммунодиагн. Immunother. 33, 192–198. DOI: 10.1089 / mab.2014.0049

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коларич Д., Альтманн Ф. и Сундерасан Э. (2006). Структурный анализ гликопротеинового аллергена Hev b 4 из латекса натурального каучука методом масс-спектрометрии. Biochim. Биофиз. Acta 1760, 715–720. DOI: 10.1016 / j.bbagen.2005.11.012

CrossRef Полный текст |

Экономика и экономика

Каждая группа людей должна решить три основные проблемы повседневной жизни: какие товары и услуги производить, как производить этих товаров и услуг и для кого производить эти товары и услуги.

Экономика - это исследование того, как общество решает, что, как и для кого производить.

Экономика - это общественная наука, изучающая производство, распределение и потребление товаров и услуг.Термин экономика происходит от греческого слова oikos (дом) и nomos (обычай или закон), следовательно, «правила дома (владение)».

Под товарами мы подразумеваем такие физические товары, как сталь, автомобили и клубника. Под услугами мы подразумеваем такие виды деятельности, как массаж или живые театральные представления, которые можно использовать или наслаждаться только в момент их создания. В исключительных обстоятельствах общество может обнаружить, что на некоторые вопросы о том, что, как и для кого производить, уже даны ответы; до прибытия Человека Пятницы Робинзону Крузо не нужно беспокоиться о вопросе «для кого».Однако в целом общество должно ответить на все три вопроса.

Подчеркивая роль общества, определение помещает экономику в социальные науки, науки, изучающие и объясняющие человеческое поведение. Предметом экономики является та часть человеческого поведения, которая связана с производством, обменом и использованием товаров и услуг. Центральная экономическая проблема для общества состоит в том, как примирить конфликт между практически безграничными желаниями людей в отношении товаров и услуг и нехваткой ресурсов (рабочей силы, оборудования и сырья), с помощью которых можно производить эти товары и услуги.Отвечая на вопросы, что, как и для кого производить, экономика объясняет, как ограниченные ресурсы распределяются между конкурирующими требованиями об их использовании. Экономика касается человеческого поведения. Экономисты анализируют проблемы, а не предмет экономики. Экономисты стремятся разработать теории человеческого поведения и проверить их на фактах.

Современная рыночная экономика состоит из трех типов экономических агентов, взаимодействие которых составляет экономическую деятельность: потребители, производители и правительство.Основная социальная цель экономики - производить товары и услуги для удовлетворения потребностей и желаний потребителей.

Потребители, как правило, представляют домохозяйства, которые предоставляют рабочую силу и другие ресурсы для производства за счет дохода, который они используют для покупки потребительских товаров или сбережений.

Производители, как правило, представляют предприятия или фирмы, которые приобретают факторы производства или вводят рабочую силу, землю и капитал у домашних хозяйств и объединяют их для производства продукции или товаров, которые можно классифицировать в товары, материальные товары и услуги.Деятельность фирм сводится к продаже своей продукции с прибылью.

Третий базовый элемент, правительство, вовлечено в экономику, с одной стороны, как производитель и потребитель, а с другой стороны, как регулирующий, контролирующий и поддерживающий экономическую деятельность.

Экономические агенты вовлечены в сложную сеть операций, в которых участвуют факторы производства и результаты. Однако объем товаров, которые можно производить и покупать, ограничен нехваткой ресурсов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *